CRISPR

Extended Research

CRISPR-Cas9 기술이 유전자 편집 분야에서 유례없는 성공을 거두면서 후속 연구들을 통해 Base editor 및 Prime editor를 포함한 수많은 새로운 CRISPR 기반 도구가 등장하였습니다. 이러한 도구들은 각각 Cas9을 기반으로 한 응용 도구로서 목적에 따라 유전자 편집을 훨씬 용이하게 할 수 있습니다. Cas9 기반 도구이므로 CRISPR-Cas9 원천특허가 중요시되며 툴젠은 다양한 원천기술에 대한 확장을 위해 다양한 연구개발 활동이 진행 중입니다.

Cpf1 및 Sp. Cas9외의 Cas기반 유전자 편집 tool은 모두 Sp. Cas9에 비해 작동하는 타겟의 개수도 적고 효율도 대부분 낮은 것으로 나타났습니다. 많은 타겟 개수와 높은 효율로 인한 부작용으로 Sp. Cas9은 이러한 새로운 도구들에 비해 높은 비표적 편집 효율(off-target effect)을 보인다는 단점이 있어 왔습니다. 최근 툴젠은 이러한 한계를 극복하여 높은 효율은 유지하면서 비표적 편집 효율은 획기적으로 감소시킨 변이 Sp. Cas9인 Sniper2L을 개발하여 이러한 단점을 해결하고 있습니다.

Sp. Cas9는 Base-editor와 Prime-editor와 같은 새로운 도구들의 구성 요소로서 핵심적인 역할을 수행할 뿐만 아니라 더 다양한 역할을 수행할 수 있습니다. 예를 들어 Base-editor나 Prime-editor는 특정 DNA 염기를 변경하는 데 매우 효과적일 수 있지만, 적용 범위가 제한적입니다. 반면 Sp. Cas9는 유전자 Knock-out, Knock-in, Large deletion, CRISPRi, CRISPRa등 광범위한 작업들에 활용될 수 있습니다. 또한 Sp. Cas9는 Cpf1에 비해 타겟팅 시퀀스의 범위가 넓습니다. Cpf1의 경우 TTTV의 PAM(protosacer adjacent motif) 서열을 가지는데 이로 인해 NGG의 PAM 서열을 가진 Sp. Cas9에 비해 목표 시퀀스의 범위가 훨씬 더 제한적입니다. 게다가 Sp. Cas9는 새로운 툴들과 비교했을 때 가장 심도 있게 연구되었습니다. Sp. Cas9의 작용 메커니즘, 부작용 및 다양한 delivery tool들을 적용했을 때의 효율의 차이 등 다양한 분야에서 방대한 양의 연구 문헌이 출판되었습니다.

결국, Cpf1, Base-editor, Prime-editor 같은 CRISPR 유전자 교정 도구는 지속적으로 개발되고 있으나 높은 효능, 다양한 application, 넓은 타겟팅 시퀀스 및 광범위한 문헌으로 인해 Cas9은 유전자 편집을 위한 강력하고 다재 다능한 도구로서의 압도적인 우위를 유지 중입니다. 유전자 편집 분야가 계속 진화함에 따라 새로운 도구가 등장할 것으로 보이지만 Sp. Cas9의 입증된 효능과 다재 다능성은 앞으로 수년간 유전자 편집 연구의 최전선을 유지할 것으로 보입니다.

Extended Research

Sp. Cas9 기술이 유전자 편집 분야의 표준으로 자리 잡으면서, 임상 단계의 유전자 치료제 및 정밀 농업 등 실제 산업 적용을 위해 안전성을 극대화하려는 후속 연구가 활발히 진행되었습니다. 이러한 흐름 속에서 유전자 교정의 오프타겟(Off-target) 부작용을 제어하는 것은 상용화를 위한 필수 과제가 되었으며, 툴젠은 기존 Sp. Cas9의 한계를 뛰어넘는 차세대 원천기술 확보를 위해 다양한 연구개발 활동을 전개해 왔습니다. 그 결과로 탄생한 것이 바로 초정밀 유전자가위인 Sniper 2L입니다.

기존에 개발된 다른 고정밀(High-fidelity) 변이 Cas9 도구들은 오프타겟 효과를 줄이는 데는 일정 부분 성공했으나, 그 대가로 타겟 유전자에 대한 교정 효율(On-target)이 야생형(Wild-type) Sp. Cas9에 비해 현저히 낮아진다는 치명적인 단점이 있었습니다. 반대로 높은 효율을 자랑하는 기존 Sp. Cas9은 비표적 부위에 돌연변이를 일으킬 위험이 상대적으로 높았습니다. 최근 툴젠은 단백질 공학적 최적화를 통해 이러한 상충 관계(Trade-off)를 완벽히 극복하여, 야생형 수준의 강력한 교정 효율은 유지하면서 비표적 편집 효율은 획기적으로 감소시킨 변이체 Sniper 2L을 개발하여 유전자 가위의 안전성 난제를 해결하고 있습니다.

Sniper 2L은 단독 유전자 교정 효소로서의 가치뿐만 아니라, Base-editor 및 Prime-editor와 같은 새로운 도구들의 구성 요소로서 훨씬 더 다재다능한 역할을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 기존 Base-editor나 Prime-editor 시스템의 골격을 Sniper 2L로 교체할 경우, 해당 도구들이 가지는 근본적인 오프타겟 위험을 획기적으로 낮추어 매우 안전한 정밀 편집 도구로 업그레이드할 수 있습니다. 또한 Sniper 2L은 기존 Sp. Cas9과 동일한 NGG의 PAM(protospacer adjacent motif) 서열을 인식하므로 타겟팅 시퀀스의 범위가 넓습니다. 이는 유전자 Knock-out, Knock-in, Large deletion 등 기존 Sp. Cas9이 활용되던 광범위한 작업에 그대로 대체 적용이 가능함을 의미하며, Sp. Cas9에 대해 축적된 방대한 연구 문헌과 다양한 delivery tool 데이터 등을 그대로 활용할 수 있다는 엄청난 이점을 제공합니다.

결국, 오프타겟을 줄이기 위한 새로운 정밀 유전자 교정 도구들은 지속적으로 개발되고 있으나, 높은 효능(On-target), 탁월한 안전성(저 Off-target), 기존 플랫폼과의 완벽한 호환성 및 광범위한 확장성으로 인해 Sniper 2L은 정밀 유전자 편집을 위한 강력하고 다재다능한 도구로서 압도적인 우위를 확보하고 있습니다. 유전자 편집 분야가 실제 임상 치료 및 상용화 단계로 진화함에 따라 ‘안전성’이 가장 중요한 척도가 될 것이며, 입증된 효능과 혁신적인 정밀함을 모두 갖춘 Sniper 2L은 앞으로 수년간 유전자 치료제 및 정밀 의료 연구의 최전선을 이끌어갈 것으로 보입니다.

Extended Research

CRISPR-Cas9 시스템이 유전자 교정의 핵심 도구로 자리 잡으면서, 이를 세포 내로 얼마나 안전하고 효율적으로 전달(Delivery)할 것인가에 대한 연구가 유전자 교정 기술 상업화의 성패를 가르는 핵심 과제가 되었습니다. 초기 유전자 교정 연구는 주로 플라스미드 DNA(Plasmid DNA)나 바이러스 벡터(Viral vector)를 매개로 이루어졌으나, 최근에는 Cas9 단백질과 가이드 RNA(sgRNA)를 체외에서 미리 결합한 완성형 복합체인 RNP(Ribonucleoprotein) 직접 전달 방식이 차세대 표준으로 자리매김하고 있습니다. RNP 전달 플랫폼은 유전자 교정의 정확도와 안전성을 극대화할 수 있어, 치료제 개발 및 종자 개량 등 응용 분야에서 필수적인 기술로 평가받고 있습니다.

DNA나 바이러스 벡터를 이용한 전달 방식은 유전자 가위가 세포 내에서 장기간 발현되도록 유도하기 때문에, 높은 교정 효율을 얻을 수 있는 반면 비표적 편집(Off-target effect)의 발생 확률 역시 기하급수적으로 높아진다는 치명적인 단점이 있습니다. 게다가 외부 DNA가 숙주 세포의 유전체에 무작위로 삽입(Insertional mutagenesis)될 위험성을 내포하고 있습니다. 반면, CRISPR RNP는 세포 내에 투입된 직후 표적 유전자를 즉각적으로 편집한 뒤, 세포 내 효소들에 의해 수일 내로 빠르게 분해됩니다. 이러한 ‘Hit-and-run’ 작용 메커니즘 덕분에 오작동할 수 있는 시간적 여지를 차단하여 비표적 편집을 획기적으로 감소시킵니다. 특히 앞서 언급된 툴젠의 고효율·고정확도 변이 효소인 ‘Sniper2L’을 RNP 형태로 적용할 경우, 효소 자체의 정밀도와 전달 방식의 안전성이 시너지를 일으켜 오프타겟 이슈를 사실상 제로(0)에 가깝게 통제할 수 있습니다.

CRISPR RNP는 기존 방식으로는 접근이 어려웠던 고난도 작업에서 더욱 빛을 발합니다. 예를 들어, 차세대 면역항암제로 각광받는 CAR-T 세포 치료제 등을 개발할 때 사용되는 1차 세포(Primary cell)나 줄기세포는 외부 DNA가 주입될 경우 강한 독성 반응(Toxicity)과 면역 반응을 일으켜 세포가 사멸하는 경우가 많습니다. 그러나 단백질-RNA 복합체인 RNP는 DNA 독성 반응을 유발하지 않아 세포 생존율을 극대화할 수 있습니다. 또한, 단일가닥 DNA(ssODN)와 RNP를 함께 주입하는 방식을 통해 정교한 유전자 삽입(Knock-in) 효율을 비약적으로 끌어올릴 수 있으며, 이는 유전 질환의 근본적인 치료를 위한 핵심 기전이 됩니다. 농생명 분야에서도 RNP 방식은 외부 외래 유전자가 최종 산물에 전혀 남지 않는 ‘DNA-free’ 방식이기 때문에, 기존 GMO(유전자 변형 생물체) 규제에서 면제되거나 완화된 기준을 적용받는 데 절대적인 우위를 점하고 있습니다.